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关于光合作用测量仪器,您必须知道的使用要点
日期:2020-03-12 17:27:10

提起光合作用测量仪器,

可能很多人都会答,

这个我知道,光合仪和荧光仪嘛!

那我再问,光合仪和荧光仪具体都测什么?

如何选择?哪个更好用?

突然好多概念,参数浮现在脑海,

我们好像在哪见过!

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OK!坐好,手背后边,

睁大眼睛,竖起耳朵,

听小编来给你们“瞎扯”一番。


—— 光合作用的光&合 ——


Photosynthesis=Photon(光)+Synthesis(合),光合作用可分为光反应和暗反应。


光反应:发生叶绿体的类囊体膜上,以光能捕获传递转化为基础的光能利用,氧气释放和电子传递。


暗反应:发生在叶绿体基质内,以CO2吸收同化合成为基础的酶促反应,羧化,还原,再生。


>> 总结 <<


光反应:反应相对快,光子转化成电子实现太阳能的初级利用。涉及到光能转换效率,激发能耗散途径,电子传递速率,NADPH和ATP合成。


暗反应:反应相对慢,吸收CO2,通过酶促反应利用光反应产生的还原剂,合成糖类,淀粉,实现活跃化学能到稳定化学能的转化。涉及气孔导度,叶肉导度,蒸腾速率,羧化效率。

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—— 光反应和暗反应的测量仪器 ——


光合仪:气体交换原理,利用红外气体分析器(InfraRed Gas Analyzer IRGA)测量流经叶片前后CO2和H2O的浓度变化,分析叶片与环境发生的气体交换,用固定了多少CO2来表征光合作用的能力。常用的参数是净光合速率,蒸腾速率,气孔度,胞间二氧化碳浓度等。气体交换是非常经典的光合作用测量方法,光合仪是常被用来测量气体交换的仪器。


荧光仪:叶绿素荧光原理,通过检测光合作用光能利用过程中叶绿素荧光的产量(F),来分析光合作用光能吸收,转化和分配。用叶绿素荧光参数来表征不同途径能量分配的多少。常用的参数有光系统的最大光能转换效率(Fv/Fm), 实际光能转换效率(Yield), 光化学淬灭(qP), 非光化学淬灭(NPQ), 电子传递速率(ETR)等。叶绿素荧光法具有无损,原位测量等优势,可以作为光合作用的有效探针,叶绿素荧光仪广泛应用于实验室和野外光合作用研究。


>> 总结 <<


光合作用和蒸腾作用相伴发生,光合仪测量叶片和环境的气体交换。交换的气体是H2O和CO2,交换的门户是气孔,交换的结果是水分从叶片中蒸腾散失,CO2进入叶片被同化。光合仪测量光合作用极易受到环境湿度,CO2浓度,光照,温度的影响,测量过程中应尽量保持环境条件稳定。


光能的吸收与耗散平衡,荧光仪测量吸收光能中用于发射荧光的部分,根据模型计算转化为光合电子传递和热耗散的部分。荧光仪测量的叶绿素荧光通常指的是室温(25℃)叶绿素荧光,荧光仪测量光合作用主要受光照强度(PAR)和温度的影响。


—— 如何选择或哪个更好用?——


任何一种仪器的选择,

都要服从科研内容对工具的需求!


举个例子,一个种质资源管理中心,如果要收集200个水稻品种的田间光合特性数据,可以尝试使用荧光仪测量实际光能转化效率即可,荧光仪可以在短时间内测量大量样品。换一个角度,如果是要评估改良的新品种和本之间的光合差异,则建议使用光合仪来测量,毕竟固定CO2生成糖和淀粉才是作物产量的保证。你品,你细品!


光合仪和荧光仪可以独立存在,但是光反应和暗反应不会独立运行。所以,两者没有绝对意义上的高下,因为光反应和暗反应同样重要。如果想全面的分析光合作用,光合仪和荧光仪都需要用到,最佳的使用方案是联用,同步测量气体交换和叶绿素荧光。


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—— 使用光合仪和荧光仪要注意什么?——


>> 光合仪 <<


1、预热!预热!预热!所有IRGA原理的光合仪都需要预热!不同品牌的光合仪预热时间不同,实际应用中预热的时间约为30-60分钟。


2、分析器调零,调零的目的是为了消除光合仪的检测误差。不同品牌,不同型号的光合仪,根据IRGA类型的不同,调零模式有差异。目前比较常见的是双通道四分析器光合仪,双通道是Reference和Sample两股气路通道,四分析器分别是H2O Reference分析器和CO2 Reference分析器,H2O Sample分析器和CO2 Sample分析器。在测量叶片前先测量分析器的读数差异并将其固定即视为调零,之后才可以进行气体交换的测量。


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调零气路

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测量气路


3、精确控制环境因子(光、温、水、气),光合仪主要采用开放式气路系统,即光合仪从环境中吸取空气,测量流经叶片前后CO2和H2O的浓度变化,测量后的气体从出气口流走。环境空气的温度,湿度,CO2浓度及环境的光强剧烈波动会严重影响光合仪的使用。因此建议在使用过程中精确控制环境因子。


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4、原位测量,严禁离体,因为离体叶片生理状态会发生变化,最明显的就是气孔关闭。除了离体损伤之外,可能会导致气孔关闭的还有手上的汗液或化妆品残留等,所以不要直接用手擦拭叶片。


5、叶片面积(或重量),光合仪计算的光合速率是单位面积(或重量),单位时间内的CO2同化率,测量时需要已知的测量面积(或重量)。现在有些品牌的光合仪允许测量完成后修正测量面积(或重量),重新计算光合速率,如德国WALZ的GFS-3000。


6、叶片温度,叶片温度是计算光合参数和控制气体交换温度的重要依据。因为光合仪的测量原理默认肉细胞内为100% 相对湿度。


7、叶室气流流速,流经叶室的气流流速,与气体交换参数计算有关。光合能力弱的阴生植物可以尝试低流速测量。


8、日常维护,光合仪属于精密的气体分析仪器,为保证测量的准确性,应该定时做标定,标定程序分为CO2和H2O分析器零点标定和CO2和H2O分析器跨度标定。光合仪在环境因子控制过程中会消耗一些药品,如干燥剂和碱石灰等,使用前后要注意检查。光合仪作为野外便携式测量设备,时常会被带到野外去实验,使用中务必留意电池电量状况,及时保存数据,使用前后及时给电池充电。特别提醒,远离水源!


>> 荧光仪 <<


1、荧光仪的种类,目前常用的叶绿素荧光仪有两种,脉冲调制式的和连续激发式的。脉冲调制式的可以在有环境光为背景的情况下使用,连续激发式的不可以。但是连续激发式的时间分辨率比脉冲调制式的高。脉冲调制式的叶绿素荧光仪通常用来测量淬灭分析,快速光曲线等。连续激发式的通常用来做快分析。


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2、暗适应,为了更好的对叶绿素荧光测量进行合理的解释,如何定义光合机构在测量开始时的状态非常重要。所以,在大多数实验中,无论脉冲调制式还是连续激发式叶绿素荧光仪,测量前一般需要首先进行暗适应。叶片的暗适应状态是光合机构的基本状态。暗适应的方式有很多种,整株植物置于暗室,单个叶片放入暗适应夹,夜间测量。暗适应的时间长短取决于我们希望从叶绿素荧光中得到什么信息。例如,大田作物叶片光合能力评价,暗适应时间一般只需要30分钟。而实验室内拟南芥叶片跨膜质子梯度ΔpH的测量则需要几个小时甚至更长。


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3、荧光仪光源,在荧光参数测量前对荧光仪光源有明确的认识是非常有必要的。以调制式的叶绿素荧光仪为例,通常会配置四种光,测量光ML,光化光AL,饱和脉冲光SP,远红光FR。测量光,光强比较弱(<1μmolm-2s-1),具有调制频率,用于信号检测,测量前需要调整测量光强度(Int.)和频率(Freq.)使荧光信号达到基本检测要求。测量光强度过高, Fm 测定时可能会因为过饱和被低估,如果测量光强度太低,则不会使用满量程,误差增大。光化光,是诱导植物发生光合作用的光,又叫作用光。常见的荧光仪光化光光源有两种, 460nm左右的蓝光或630nm左右的红光。光化光的强度通常也是可以调节的,以适应不同的实验需求。但是请注意,光源出口与样品的距离会改变样品表面的光强。所以测量前务必明确到达样品表面的光强具体是多少。很多设备的出厂设置都是预设的,安装调试时最好执行光强校准,确保软件或者报告里的PAR值与样品水的实际光强值一致。饱和脉冲,脉冲调制式荧光仪除了上述两种光还有一种饱和脉冲光,而连续激发式荧光仪通常只有饱和脉冲光。饱和脉冲在荧光仪中通常是用来计算数据的,光强比较强,一般都要大于3000μmolm-2s-1。为适应不同样品类型和实验要求,饱和脉冲的强度和持续时间通常也是可以调节的。远红光,有些品牌或型号的荧光仪还会搭载用于激发光系统Ⅰ的远红光,远红光可以用来测量Fo’,暗弛豫,状态转换。


4、Fv/Fm, (Fm-Fo)/Fm,最大光能转换效率,反应植物潜在的最大光合能力。通过测量暗适应之后的最小荧光Fo和最大荧光Fm计算而来。该参数相对独立,可以单独使用,来评估胁迫条件下植物的光合特性变化或用来筛选突变体。大多数荧光仪都可以测。


5、ΦPSII,(Fm’-F)/Fm’, 实际光能转换效率,反应植物在稳态下的实际光合能力,通过测量稳定环境(光温水汽)状态下的最小荧光F和最大荧光Fm’计算而来。可以在晴朗的天气,快速测量大量植物的光合特性。测量过程要同时采集环境参数,如光强,温度等。


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6、诱导曲线,Induction Curve,慢速荧光诱导动力学(Slow Kinetics)的一种。测量诱导曲线可以获得淬灭分析(Quenching Analysis)的参数,光化学淬灭(qP), 非光化学淬灭(NPQ)。实际应用中,诱导曲线后可以增加暗弛豫的测量,进一步分析植物非光化学淬灭的能力。完整操作如下,先通过光化光诱导植物叶片达到稳态,测量光化学淬灭和非光化学淬灭。然后关闭光化光,打开远红光,继续测量,直到植物在暗处再次达到稳态,测量暗稳态下的荧光淬灭。谨记,诱导曲线的测量需要暗适应。


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7、光曲线,Light Curve,测量不同光强下的量子产量,计算电子传递速率ETR(ETR=PAR*Yield*吸光系数*0.5)。光曲线是光响应曲线的一种表征方式,相对于光合仪测气体交换的A/Q曲线,荧光仪测量light Curve的时间可以短得多,所以又被称为快速光曲线(RLC)。光曲线可以拟合得到光能利用效率α,最大电子传递速率ETRmax,半饱和光强Ik,实现不同样品光合特性的对比。


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8、荧光成像,普通的荧光仪通常以数据报告的形式呈现测量结果,而荧光成像则可以将数据图像化,直观的展现样品间的光合特性差异,极大地扩展了叶绿素荧光技术的应用。如今,荧光成像早已经成为光合生理研究,遗传育种,突变体筛选,病虫害早期检测的常用工具。相比于普通的荧光仪,荧光成像的测量面积大,全叶片成像有助于分析叶片的横向异质性。荧光成像并不是面积越大越好,比面积更重要的是成像区域光场的均一性。均匀的广场保证了叶片每一个部位的照光条件一致,实验结果才更可靠。所以荧光成像的光源布局要经过精心的的设计,就像手术台的无影灯,照亮每一个看得见的角落。

        

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荧光参数图像(Belén Naranjo,etal. 2016)


再次声明,光合作用研究仪器没有好坏之分,DIY或Custom-Made的测量系统照样可以发好文章。正所谓光合仪器测量的数据千篇一律,有趣的idea万里挑一。再次祝各位老师,用好仪器,做好实验,讲好故事,发好文章!


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